同济大学孙瑶教授、杜建忠教授、范震研究员研发超声触发的仿生超短肽纳米纤维水凝胶通过调节成骨免疫微环境促进骨再生 | BAM

近期，同济大学孙瑶教授、杜建忠教授、范震研究员在科爱创办的期刊Bioactive Materials上联合发表文章：目前，超短肽在生物医学领域的应用不断得到拓展，研究者基于恢复骨组织细胞外基质稳态理念，设计构建了超声响应的仿生超短肽纳米纤维水凝胶。在超声刺激下超短肽纳米纤维从水凝胶中释放，实现激活M2型巨噬细胞线粒体代谢和三羧酸循环，增强细胞极化，并通过触发M2细胞分泌促成骨的生长因子，加速骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化，为重建成骨免疫微环境、加速损伤修复提供了一种新的策略。

01

研究内容简介

随着老龄人群不断增加，由肿瘤、创伤、感染引起的骨缺损的再生已成为重要的临床挑战。骨缺损区域的免疫微环境极大地影响了骨再生的效果。然而，如何优化骨缺损再生免疫微环境，其有效策略仍有待进一步研究。随着对生物矿化关键分子的认识不断加深，超短肽在调控细胞分化、促进成骨方面展现出了良好的前景。为了有效地实现骨缺损修复过程中促进M2型巨噬细胞极化、改善免疫微环境，该团队开发了一种基于超短肽纳米纤维的超声响应性水凝胶。该超短肽采用M2极化模块结合自组装模块的模块化设计。与肽单体相比，自组装超短肽纳米纤维有效地增强了体内稳定性，有效诱导M2型巨噬细胞极化。此外，合成的超声触发性水凝胶，能够原位封装肽纳米纤维，填充骨缺损空间并实现超短肽控制释放能力。在骨缺损部位的超声刺激后，超短肽纳米纤维从水凝胶中响应性释放，以调节M2型巨噬细胞的形成，促进骨缺损的修复。释放的超短肽纳米纤维既通过激活巨噬细胞线粒体氧化应激、抑制活性氧的释放产生、诱导M2型巨噬细胞，又通过分泌BMP-2和IGF-I加速骨髓间充质干细胞的成骨分化。该研究对超短肽纳米纤维水凝胶的功能展示反映了生物活性材料科学的前沿，揭示了基于肽类分子的生物活性材料在骨缺损修复中的重要应用前景。

方案1：超短肽模块化自组装成纳米纤维水凝胶，介导M2型巨噬细胞极化，促进骨缺损再生

一、UPN@hydrogel的合成及表征

首先，通过CFF-SESSE的自组装制备了肽纳米纤维。如图1A所示，在扫描电镜图像中观察到交联的纳米纤维网络。然后，海藻酸钠与纳米纤维一起原位合成了海藻酸钙水凝胶（UPN@hydrogel）。为了验证UPN@hydrogel的成功合成，我们预先制备了FITC标记的肽纳米纤维。如图1B所示，绿色荧光呈均匀分布，证实了肽纳米纤维在水凝胶中的均匀分布。图1C显示超声响应能够加速UPN@hydrogel的释放。超声刺激终止后，水凝胶持续释放肽纳米纤维。将UPN@水凝胶浸泡在PBS溶液（pH 6.0和7.4）中，模拟骨缺损区酸性微环境，超声响应能够加速水凝胶重量的丢失（图1D-E）。扫描电镜图像观察到超声刺激下UPN@hydrogel发生更多的空腔（图1F-G）。通过小动物全身荧光成像研究了没有超声（图1I）或有超声（图1J）的骨缺损中，水凝胶在体内降解的动力学，定量显示超声响应加速了体内水凝胶的降解（图1H）。

图1：UPN@hydrogel形态学特征和超声响应性评估

二、UPN调节巨噬细胞线粒体代谢和氧化应激

首先采用免疫荧光法研究了巨噬细胞对超短肽纳米纤维的吞噬作用。结果显示，在6h后，UPN开始被巨噬细胞吞噬，随着孵育时间的延长和UPN刺激浓度的增加，UPN被巨噬细胞吞噬增加（图2A）。然而，超短肽纳米纤维并没有明显被骨髓间充质干细胞吞噬（图2B）。巨噬细胞的代谢组学分析显示，UPN刺激的巨噬细胞与糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）密切相关，提示UPN可以激活巨噬细胞的糖酵解和三羧酸循环（图2C-E）。代谢组学定量分析显示，UPN抑制了三羧酸循环中琥珀酸的代谢（图2F）。同时，UPN降低了巨噬细胞EMP中乳酸（图2G）和葡萄糖6磷酸的产生（图2H）。透射电镜显示UPN诱导线粒体的形态从原始棒球样形态膨胀成椭圆形状态（图2I）。UPN刺激巨噬细胞后，发现UPN组中线粒体肿胀的比例进一步增加（图2J）。此外，线粒体/细胞比值结果显示，与Ctrl组相比，UPN组进一步增加线粒体的数量（图2K）。线粒体膜电位JC-1的免疫荧光结果显示，UPN可以提高JC-1聚合物的表达量，（图2L-M）。ATP检测显示，UPN促进了巨噬细胞线粒体中的三羧酸循环，提示巨噬细胞的能量代谢被激活（图2N）。巨噬细胞中的总ROS用DCGH-DA标记（图2O），线粒体中的ROS用MitoSox标记（图2P），流式细胞术结果显示，UPN可以减少巨噬细胞中ROS的释放，并且减少线粒体中ROS的释放（图2Q-R）。综上所述，UPN能够调节线粒体代谢，增强MMP活性，减少ROS的释放。

图2：UPN调节巨噬细胞线粒体代谢和氧化应激

三、UPN促进M2型巨噬细胞的极化

单体肽(UP)治疗小鼠骨缺损14天后，进行基因转录测序分析显示，M2型巨噬细胞标记物Arg1和CD163的表达显著增加（图3A）。在骨缺损区域用超声响应性超短肽纳米纤维水凝胶（US+UPN@hydrogel）治疗14天后，用F4/80和CD206标记M2型巨噬细胞（图3B-C）。流式细胞术显示CD206标记的M2型巨噬细胞数量占巨噬细胞总数的百分比增加（图3D），而CD86标记的M1型巨噬细胞没有显著差异（图3E）。免疫荧光结果显示，US+UPN@hydrogel能够增加骨缺损处CD206的表达（图3F）。为了揭示仿生肽纳米纤维与巨噬细胞之间的相互作用，IL-4与骨髓巨噬细胞（BMDMs）孵育，免疫荧光显示UPN能够进一步促进IL-4介导的M2型巨噬细胞标志物Arg1和CD206的表达（图3G-I）。流式细胞术结果显示UPN同样能够进一步促进CD163和CD206标记的M2型巨噬细胞表达（图3J-M）。RT-qPCR结果显示，UPN显著增加了Arg1和CD206的表达（图3N-O）。同样，Westorn Blot结果显示UPN明显促进Arg1和CD206蛋白的表达（图3P）。综上所述，这些发现提示M2型巨噬细胞在UPN@hydrogel治疗后的骨缺损再生过程中起重要作用，超声触发进一步促进了M2型巨噬细胞的极化。

图3：UPN诱导M2型巨噬细胞的极化

四、UPN调节STAT6/PPAR-γ/SOCS3信号通路

小鼠应用UP治疗14天，转录组测序分析显示，UP与JAK/STAT信号通路密切相关（图4A-C）。为了证实UPN诱导M2型巨噬细胞极化的分子机制，免疫荧光显示UPN诱导p-STAT6荧光强度进一步增加（图4D-E）。Westorn Blot结果证实，UPN增加了巨噬细胞p-STAT6和PPAR-γ 蛋白质水平，降低了SOCS3蛋白质水平，表明UPN通过增强STAT6和PPAR-γ，抑制SOCS3，进一步促进M2巨噬细胞极化（图4F）。流式细胞术结果显示，GW9662（PPAR-γ 抑制剂）抑制了UPN诱导的M2型巨噬细胞标志物CD206的表达（图4G-H），STAT6-IN-1（STAT6抑制剂）抑制了UPN诱导的M2型巨噬细胞标志物CD206的表达（图4I-J）。以上结果表明，UPN通过STAT6/PPAR-γ/SOCS3信号轴进一步诱导M2型巨噬细胞极化。

图4：UPN诱导STAT6-PPAR-γ-SOCS3信号通路调控巨噬细胞极化

五、UPN促进骨髓间充质干细胞的成骨分化和迁移

UPN诱导BMSCs和BMDMs共培养示意图（图5A），碱性磷酸酶染色检测7天（图5B-C）和14天（图5D-E）共培养系统中，骨髓间充质干细胞的成骨矿化。此外，茜素红染色显示，在共培养系统中第21天，UPN促进BMSCs矿化结节数量（图5F-G）。同时，该文章评估了骨髓间充质干细胞在共培养系统中的迁移能力。Transwell迁移实验显示，随着时间的延长，UPN显著增加了迁移细胞的数量（图5H-J）。RT-qPCR检测骨髓间充质干细胞成骨相关基因，包括碱性磷酸酶（ALP）和细胞相关转录因子2（Runx2），结果表明，超短肽纳米纤维可以显著提高骨髓间充质干细胞的成骨分化（图5K-L）。此外，UPN进一步促进了巨噬细胞分泌的生长因子骨形态发生蛋白2（BMP-2）和胰岛素样生长因子（IGF-1）。以上结果提示，UPN可能通过旁分泌BMP-2和IGF-1生长因子促进于骨髓间充质干细胞成骨分化（图5M-N）。

图5：UPN促进骨髓骨髓间充质干细胞的成骨分化和迁移

六、超声响应性UPN@hydrogel在骨缺损治疗中的作用

构建SPF级8周龄C57BL/6J小鼠骨缺损模型，采用超声触发性的UPN@hydrogel（US+UPN@hydrogel）观察愈合过程（图6A），采用micro-CT成像观察不同组骨缺损的愈合效果。术后治疗14天，获得骨缺损部位的显微CT重建图像（图6B）和X-ray图像（图6C）。定量分析缺损的愈合区域的骨体积/组织体积（BV/TV）和骨小梁厚度(Tb.Th）。结果显示US+UPN@hydrogel组具有更好的骨愈合效果（图6D-E）。此外，从骨缺损部位的组织中提取组织蛋白，Western Blot结果显示，US+UPN@hydrogel组的成骨蛋白标志物BMP2和Col1水平增高（图6F）。H&E染色评价小鼠骨缺损的愈合能力，发现小鼠骨缺损区US+UPN@hydrogel治疗后，加速了新形成的骨小梁被再生的骨皮质所取代（图6G）。免疫荧光检测成骨基因标记物BMP2，US+UPN@hydrogel的荧光强度最高（图6H），证实了应用超声触发的超短肽纳米纤维水凝胶材料可以有效改善骨缺损的再生。

图6：UPN超声反应性UPN@hydrogel促进小鼠骨缺损再生

六、UPN@hydrogel的体内毒性研究

在该研究中，超声响应性单体肽水凝胶（US+UP@hydrogel）和超声响应性肽纳米纤维水凝胶（US+UPN@hydrogel）进行骨缺损14天治疗后，H&E染色检测了心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的毒性，结果显示这些器官没有炎症浸润或病理改变（图7A）。同时，提取血清样本，以研究肝、肾和心脏功能的潜在病理性改变，检测的肝功能指标，包括碱性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）和总胆红素（TBIL）（图7B-D)。肾功能指标包括尿素（UREA）、尿酸（UA）和肌酐（Crea）（图7E-G)。心功能指标包括乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）（图7H-J)。结果显示治疗后的肝肾、心功能均在正常范围内，没有明显的炎性因子IL-6、IFN-r和CXC10的改变（图7K-M)。

图7：UPN的体内毒性研究

最后作者指出这是一种超声触发的肽纳米纤维水凝胶，可以有效地促进骨再生。超短肽SESSE设计了M2巨噬细胞极化模块和自组装模块来改变巨噬细胞的状态。释放的超短肽纳米纤维激活巨噬细胞线粒体的氧化应激，进而抑制活性氧的释放，同时诱导M2型巨噬细胞加速骨髓间充质干细胞的成骨分化。综上所述，本研究为活性超短肽组织工程提供了一条新的途径，基于超短肽的生物活性材料可以通过调节免疫微环境促进组织损伤再生。

02

论文第一/通讯作者简介

第一作者：张璠

同济大学口腔医学院博士研究生。

共同通讯作者：孙瑶、杜建忠、范震

孙瑶：同济大学口腔医学院教授、博士生导师，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心常务副主任，院党委副书记。中华口腔医学会口腔遗传病专委会副主任委员。长期从事牙齿和骨发育矿化及相关疾病研究，聚焦探索细胞外基质蛋白和细胞纤毛对硬组织矿化的关键调控作用，多项研究成果以第一作者或通讯作者发表于 Nature Metabolism, Nature Communications, ASC Nano, Journal of Biological Chemistry, Journal of Dental Research 等。

杜建忠：同济大学长聘特聘教授，同济大学高分子材料系主任，材料学院教授委员会副主任，上海特聘专家，上海高校特聘教授（东方学者）。围绕生物医用高分子囊泡领域的关键科学问题开展研究，构建了非均相膜、非对称冠、膜冠融合高分子囊泡，为构建血糖调控、血管成像、肿瘤诊疗、抗菌等生物医用高分子材料提供了新思路。以通讯作者在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem., Adv. Mater., Nat. Commun., Adv. Funct. Mater., Nano Lett., ACS Nano, Chem. Mater., Biomaterials, J. Controlled Release, Macromolecules, ACS Macro Lett., Chem. Soc. Rev., Prog. Polym. Sci.等，获国家科技进步奖二等奖（3/15）。

范震：同济大学材料科学与工程学院，高分子材料系，研究员。主持国家自然科学基金优秀青年科学基金项目，上海市教委人才项目，上海高校特聘教授（东方学者）。以通讯作者在Chemistry of Materials，ACS Nano，Advanced Functional Materials，Biomaterials，Nature Communications等期刊共发表SCI论文多篇。

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资助信息

该研究获得国家重点研发计划（2022YFA1103200）、上海市教委科研创新计划（2023ZKZD29）、国家自然科学基金项目（81822012、82061130222、81771043、22075212、21925505、82350003、92049201），上海市科技创新行动计划学术带头人项目（20XD1424000），上海市科技创新行动计划实验动物研究项目（8191101676、201409006400），上海市国际科学合作基金项目（21520710100）的资助。

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原文信息

ZhangF, Lv M, Wang S, Li M, Wang Y, Hu C, Hu W, Wang X, Wang X, Liu Z, Fan Z*, Du J*, Sun Y*. 

Ultrasound-triggered biomimetic ultrashortpeptide nanofiber hydrogels promote bone regeneration by modulating macrophageand the osteogenic immune microenvironment. Bioactive Materials, 31 (2024) 231-246. 

DOI:10.1016/j.bioactmat.2023.08.008. 

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Bioactive Materials是一本高质量英文期刊，目前已经被SCIE、PubMed Central、Scopus、Embase收录。同时本刊还入选了2019年中国科技期刊卓越行动计划--“高起点新刊”项目。

2023年Bioactive Materials 获得影响因子18.9 ，在Materials Science，Biomaterials领域排名第一。

位于《2022年中国科学院文献情报中心期刊分区表》1区，TOP期刊。

CiteScore 2022: 19.7。